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福建蘋果酸生物煉制研究進展！
來源：www.huertalavega.com 發(fā)布時間：2020年10月20日
蘋果酸較早是由Carl Wilhelm Scheele于1785年在蘋果汁中分離得到。蘋果酸結(jié)構(gòu)上類似于琥珀酸及富馬酸，其內(nèi)在的四碳二元羧酸分子結(jié)構(gòu)拓展了蘋果酸的用途，如廣泛用于食品添加劑、醫(yī)藥化工領(lǐng)域及作為聚蘋果酸的前體物質(zhì)等。
目前，大多數(shù)工業(yè)生產(chǎn)的蘋果酸通過化學(xué)合成方法制備，酶催化法合成僅占一小部分，直接發(fā)酵法合成更少?；瘜W(xué)合成方法通過加熱馬來酸得到蘋果酸；酶催化法通過微生物中分離得到的富馬酸酶轉(zhuǎn)化富馬酸得到蘋果酸，其中富馬酸是由石化資源制得的馬來酸轉(zhuǎn)化而來。酶催化法和化學(xué)方法的原料均來自石化資源。由可再生糖質(zhì)原料直接發(fā)酵轉(zhuǎn)化制備蘋果酸，雖然尚未在工業(yè)上廣泛應(yīng)用，但顯示出了產(chǎn)品安全特性及原料供應(yīng)豐富的巨大優(yōu)勢，正在獲得越來越多的關(guān)注和研發(fā)投入。目前，蘋果酸與琥珀酸、富馬酸共同被美國能源部列為未來12種頂-級生物基平臺化學(xué)品的首-位，因此，直接發(fā)酵法代表了蘋果酸生物煉制技術(shù)的未來。
1 蘋果酸生物煉制研究現(xiàn)狀
1.1 發(fā)酵原料的范圍研究
將可再生生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物燃料、化學(xué)品及食品添加劑是當前生物化工領(lǐng)域研究的熱點課題，許多不同類型的生物質(zhì)水解產(chǎn)物均可用于制備蘋果酸。文獻報道：用玉米芯水解產(chǎn)物可生產(chǎn)蘋果酸；Rhizopus delemar菌株被用于轉(zhuǎn)化玉米秸稈水解物生產(chǎn)蘋果酸，也具有工業(yè)應(yīng)用意義；其他生物質(zhì)也可被用于蘋果酸發(fā)酵。這些研究表明，蘋果酸生物煉制的原料范圍很廣。
1.2 菌種的篩選研究
近年來，有17種微生物被用于蘋果酸轉(zhuǎn)化研究，這些微生物可分為3種類型：細菌、酵母和絲狀真菌。細菌具有發(fā)酵周期短、生長快的優(yōu)點，通常用于有機酸的工業(yè)發(fā)酵；作為模型微生物，酵母廣泛應(yīng)用于酒精發(fā)酵領(lǐng)域，雖然酵母不是重要的蘋果酸生產(chǎn)菌種，但由于其代謝能力多樣，受到廣泛關(guān)注；絲狀真菌發(fā)酵蘋果酸較大的優(yōu)勢是營養(yǎng)需求簡單，利于產(chǎn)品分離。絲狀真菌是重要的蘋果酸產(chǎn)生菌，科研人員也多圍繞該類菌種開展研究。產(chǎn)蘋果酸菌株情況見表1。Jantama等發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌KJ070能夠利用10%的葡萄糖在24 h內(nèi)生產(chǎn)626 mmol的蘋果酸；Crtereal等研究表明，漢遜酵母具有較好的生產(chǎn)蘋果酸及其他多種四碳二元羧酸的潛力。
1.3 基本代謝路徑研究
類似丁二酸及L-乳酸，蘋果酸的合成路徑引起人們重視，尤其是其工業(yè)化生產(chǎn)調(diào)控。作為四碳二羧酸重要的生產(chǎn)菌，大腸桿菌的代謝途徑被廣泛研究，也可通過琥珀酸產(chǎn)生菌的代謝修飾生產(chǎn)蘋果酸；酵母由于具有很好的pH值耐受性而被人們用于蘋果酸生產(chǎn)，13C同位素示蹤分析表明，Saccharomyces cerevisiae的蘋果酸累積通過丙酮酸的羧化、三羧酸循環(huán)及其逆循環(huán)合成而得；絲狀真菌米曲霉的13C同位素示蹤分析表明，線粒體內(nèi)TCA循環(huán)(三羧酸循環(huán))的活性對蘋果酸的分泌貢獻較大。蘋果酸生物煉制的中心代謝途徑如圖1。分析表明，細菌中蘋果酸的通量主要來源于草酰乙酸的直接代謝；酵母菌中除了草酰乙酸的代謝外，部分蘋果酸來自TCA循環(huán)；絲狀真菌中除了草酰乙酸代謝和TCA循環(huán)代謝外，蘋果酸的通量也來自蘋果酸酶的直接催化以及乙醛酸循環(huán)的代謝。
1.4 關(guān)鍵酶研究
富馬酸酶是生產(chǎn)蘋果酸的重要酶，特別是由富馬酸為原料生產(chǎn)蘋果酸時。已在釀酒酵母中檢測到富馬酸酶，并且在面包酵母細胞中測量到其高比活性。蘋果酸酶在大腸桿菌中介導(dǎo)C3代謝物羧化成C4代謝中起重要作用。研究表明，也可以通過用修飾電級再生輔酶來生產(chǎn)蘋果酸。此外，在米曲霉中檢測到丙酮酸羧化酶和蘋果酸脫氫酶的活性也是影響蘋果酸通量高低的主要原因。
蘋果酸代謝的關(guān)鍵酶見表2。對這些關(guān)鍵酶的分析表明，產(chǎn)生蘋果酸的菌株具有固定CO2的能力，并且參與TCA和乙醛酸鹽循環(huán)的合成。
1.5 代謝改造策略研究
通過對蘋果酸代謝的全-面研究，尤其是全細胞優(yōu)化的研究，人們借助代謝途徑改造生產(chǎn)多種有機酸，包括C4蘋果酸。Ye等通過從Thermococcus kodakarensis中提取蘋果酸酶來構(gòu)建體外人工蘋果酸合成途徑，發(fā)現(xiàn)其對葡萄糖的得率可以達到60%。
為了提高蘋果酸的產(chǎn)量，在大腸桿菌中實施了富馬酸還原酶的敲除以提升產(chǎn)物，根據(jù)蘋果酸的通量來源，削弱富馬酸酶可以增加蘋果酸的產(chǎn)量；同時富馬酸酶的過度表達也可以反過來從下游改善其代謝。對于釀酒酵母K-901H，Vid24p基因功能喪失導(dǎo)致了蘋果酸脫氫酶累積，進而實現(xiàn)蘋果酸產(chǎn)率的提升。所有這些改造策略顯著促進產(chǎn)物代謝。蘋果酸代謝改造策略及效果如表3。
1.6 發(fā)酵工藝研究
對于發(fā)酵過程，通常采用3種類型的發(fā)酵模型，包括深層發(fā)酵、固體發(fā)酵和酶催化。Zou等探討了深層發(fā)酵過程并進行了總結(jié)。Penicillium sclerotiorum K302可以在有氧條件下高產(chǎn)蘋果酸鈣(92.0 g/L)，該深層培養(yǎng)工藝具有較大潛力。寄生曲霉CICC40365深層培養(yǎng)8 d可得到55.47 g/L的蘋果酸，黃曲霉A-TCC13697和米曲霉QM No.821則可通過固體發(fā)酵方法生產(chǎn)蘋果酸。酶生物催化和膜分離過程被應(yīng)用于富馬酸和蘋果酸生物轉(zhuǎn)化。微生物電滲析與細胞催化相結(jié)合的方法也是一個亮點，該方法具有電耗低和外源電子利用的多種底物的優(yōu)點。
1.7 影響發(fā)酵的關(guān)鍵因子研究
影響發(fā)酵的主要因素包括溶解氧、中和劑、微生物形態(tài)、二氧化碳及細胞狀態(tài)等。
微生物在有氧(偶爾厭氧)條件下產(chǎn)生蘋果酸，其中溶解氧在細胞生長中起關(guān)鍵作用。中和劑如Ca(OH)2、Na2CO3和CaCO3通常用于控制有機酸發(fā)酵過程中的pH值。添加50 g/L的CaCO3確保了釀酒酵母在整個蘋果酸發(fā)酵過程中保持很好的發(fā)酵指數(shù)，其中CaCO3通過保持恒定的pH值在蘋果酸生物合成中起重要作用。顯著影響氧轉(zhuǎn)移速率的另一種情況是真菌的形態(tài)，當絲狀真菌在深層培養(yǎng)基中生長時，在不同的發(fā)酵過程中形成不同類型的形態(tài)。代謝網(wǎng)絡(luò)顯示蘋果酸積累的幾種途徑與CO2固定密切相關(guān)，因此CO2影響著蘋果酸的發(fā)酵。對于蘋果酸生產(chǎn)菌大腸桿菌而言，CO2參與磷酸烯醇式丙酮酸及丙酮酸的羧化。在氮饑餓條件下對米曲霉中蘋果酸生產(chǎn)狀況研究表明，氮源亞適量反而會增加蘋果酸的代謝，這可能與TCA循環(huán)的代謝、細胞呼吸和溶解氧吸收間接相關(guān)。
2.1.1 同步糖化發(fā)酵研究
纖維素原料轉(zhuǎn)化為高附加值化學(xué)品(如蘋果酸)主要包括4個加工步驟：原料預(yù)處理、水解、發(fā)酵和產(chǎn)品回收。由于同步糖化發(fā)酵提高了產(chǎn)品的整體轉(zhuǎn)化效率，是未來蘋果酸生物煉制研究的重要發(fā)展趨勢。
2.1.2 提高細胞耐受性的改善策略研究
當碳源從葡萄糖擴展到生物質(zhì)糖時，必須考慮一系列抑-制劑和所產(chǎn)生的細胞耐受性或適應(yīng)性。纖維素糖降解過程中形成或釋放多種細胞抑-制劑，特別是在預(yù)處理過程中。這些抑-制劑對微生物有一定的毒性和負面影響，例如形成的糠醛會導(dǎo)致細胞損傷。研究發(fā)現(xiàn)，參與硫同化途徑的4種基因轉(zhuǎn)錄水平能顯著保護細胞免受糠醛氧化應(yīng)激的影響，也可通過與質(zhì)膜密切相關(guān)的化學(xué)和遺傳擾動來改善細胞對乙酸抑-制劑的耐受性。如果高濃度抑-制劑在發(fā)酵系統(tǒng)中積累，則需要脫毒。
2.1.3 五六碳糖共發(fā)酵研究
拓寬生物質(zhì)糖生物轉(zhuǎn)化蘋果酸的基質(zhì)范圍對其未來成功應(yīng)用至關(guān)重要。EMP途徑的葡萄糖代謝已經(jīng)在大多數(shù)生物體中得到很好的應(yīng)用，六碳糖(低聚糖、纖維二糖、淀粉、蔗糖和麥芽糖)都通過EMP途徑引入或參與葡萄糖代謝。五碳糖(木糖和阿拉-伯糖)是來自生物質(zhì)的水解糖中的重要糖成分，含量僅次于葡萄糖。葡萄糖和木糖共同發(fā)酵蘋果酸對工業(yè)制備蘋果酸具有重要意義。六碳糖和五碳糖的共代謝途徑見圖2。
2.1.4 碳固定化的強化研究
CO2是溫室氣體的主要成分，在蘋果酸發(fā)酵過程中將CO2固定在磷酸烯醇丙酮酸或丙酮酸中會產(chǎn)生較大的益處。CO2的固定效率對蘋果酸的生產(chǎn)有積級作用，碳固定的關(guān)鍵酶主要涉及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、丙酮酸羧化酶和蘋果酸酶。Rhizopus delemar胞內(nèi)的蘋果酸酶活性非常高，在蘋果酸的總產(chǎn)量中，突變菌株中檢測到20%的通量來自蘋果酸酶對CO2的直接固定化。
2.1.5 能量平衡改善代謝研究
對于蘋果酸合成的基本代謝，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和丙酮酸羧化酶合成途徑差異顯著，丙酮酸被PC(丙酮酸羧化酶)催化為OAA(草酰乙酸)的過程凈消耗ATP。當在產(chǎn)生蘋果酸的菌株代謝中檢測到PEPCK和PC時，細胞的ATP能量平衡將起決定性作用；因此，在了解細胞能量供應(yīng)時，分析能量平衡很關(guān)鍵。類似琥珀酸等四碳二羧酸的發(fā)酵，能量不平衡也是菌種高產(chǎn)的瓶頸。當NADH(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸-還原態(tài)，還原型輔酶Ⅰ)細胞供應(yīng)不足時，可以通過氧化還原平衡和調(diào)節(jié)NADH/NAD+(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸-氧化態(tài))比例提升系統(tǒng)能量的穩(wěn)定；同時通過乙酰輔酶A代謝，可以另外獲得NADH，因此可以通過控制電子傳遞鏈來產(chǎn)生ATP。NADPH(還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，還原型輔酶Ⅱ)則在水解糖(包括六碳糖和五碳糖)的蘋果酸生物轉(zhuǎn)化中起重要作用。如果一個菌株中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的代謝成功啟動，這個關(guān)鍵途徑將產(chǎn)生雙倍還原力(NADPH)，以補償能量供應(yīng)，并進而緩解整體代謝還原力[H]的短缺(NADH和NADPH)，這是一種有效改善NADHP平衡的方法。
2.2 蘋果酸生物精煉研究的總體趨勢
2004年，美國能源部將蘋果酸列為未來高附加值生物基化學(xué)品的首-位，蘋果酸將廣泛應(yīng)用于化工、食品和制藥等各領(lǐng)域。由于人體只能代謝L-型蘋果酸，研究人員已經(jīng)提出逐漸使用L-蘋果酸代替混合型DL-蘋果酸，特別是在食品和醫(yī)藥應(yīng)用中，歐美已經(jīng)禁止混合型產(chǎn)品的亂用。由于大多數(shù)蘋果酸產(chǎn)品是通過化學(xué)方法合成的，而富馬酸酶的催化不是真正的一步發(fā)酵，并且反應(yīng)中存在其他化學(xué)殘留的可能，因此，蘋果酸的一步法生物精煉技術(shù)具有重要發(fā)展前景。
未來蘋果酸生物煉制研究總體趨勢為，在原料利用上實現(xiàn)同步糖化發(fā)酵，利用細胞耐受性的改善提高其發(fā)酵適應(yīng)性，并進而提升碳糖的共發(fā)酵、碳固定化及能量平衡能力，以提升蘋果酸產(chǎn)量。
3 結(jié)束語
利用生物煉制手段轉(zhuǎn)化可再生糖制備蘋果酸具有重要意義，其未來的發(fā)展定位是將原來的淀粉質(zhì)糖水解系統(tǒng)逐漸過渡到纖維質(zhì)水解糖系統(tǒng)，而如何克服其生物轉(zhuǎn)化過程中的諸多限制因素至關(guān)重要。本文介紹和總結(jié)了蘋果酸生物煉制流程，包括原料選擇、菌種篩選、基本代謝路徑研究、關(guān)鍵酶研究、發(fā)酵工藝研究以及關(guān)鍵影響因子研究；同時，統(tǒng)籌分析了轉(zhuǎn)化生物體的內(nèi)部代謝與外在條件之間的關(guān)聯(lián)，進而提出蘋果酸生物轉(zhuǎn)化研究的發(fā)展趨勢，期望為蘋果酸生物精煉提供一定參考。
目前，大多數(shù)工業(yè)生產(chǎn)的蘋果酸通過化學(xué)合成方法制備，酶催化法合成僅占一小部分，直接發(fā)酵法合成更少?；瘜W(xué)合成方法通過加熱馬來酸得到蘋果酸；酶催化法通過微生物中分離得到的富馬酸酶轉(zhuǎn)化富馬酸得到蘋果酸，其中富馬酸是由石化資源制得的馬來酸轉(zhuǎn)化而來。酶催化法和化學(xué)方法的原料均來自石化資源。由可再生糖質(zhì)原料直接發(fā)酵轉(zhuǎn)化制備蘋果酸，雖然尚未在工業(yè)上廣泛應(yīng)用，但顯示出了產(chǎn)品安全特性及原料供應(yīng)豐富的巨大優(yōu)勢，正在獲得越來越多的關(guān)注和研發(fā)投入。目前，蘋果酸與琥珀酸、富馬酸共同被美國能源部列為未來12種頂-級生物基平臺化學(xué)品的首-位，因此，直接發(fā)酵法代表了蘋果酸生物煉制技術(shù)的未來。
1 蘋果酸生物煉制研究現(xiàn)狀
1.1 發(fā)酵原料的范圍研究
將可再生生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物燃料、化學(xué)品及食品添加劑是當前生物化工領(lǐng)域研究的熱點課題，許多不同類型的生物質(zhì)水解產(chǎn)物均可用于制備蘋果酸。文獻報道：用玉米芯水解產(chǎn)物可生產(chǎn)蘋果酸；Rhizopus delemar菌株被用于轉(zhuǎn)化玉米秸稈水解物生產(chǎn)蘋果酸，也具有工業(yè)應(yīng)用意義；其他生物質(zhì)也可被用于蘋果酸發(fā)酵。這些研究表明，蘋果酸生物煉制的原料范圍很廣。
1.2 菌種的篩選研究
近年來，有17種微生物被用于蘋果酸轉(zhuǎn)化研究，這些微生物可分為3種類型：細菌、酵母和絲狀真菌。細菌具有發(fā)酵周期短、生長快的優(yōu)點，通常用于有機酸的工業(yè)發(fā)酵；作為模型微生物，酵母廣泛應(yīng)用于酒精發(fā)酵領(lǐng)域，雖然酵母不是重要的蘋果酸生產(chǎn)菌種，但由于其代謝能力多樣，受到廣泛關(guān)注；絲狀真菌發(fā)酵蘋果酸較大的優(yōu)勢是營養(yǎng)需求簡單，利于產(chǎn)品分離。絲狀真菌是重要的蘋果酸產(chǎn)生菌，科研人員也多圍繞該類菌種開展研究。產(chǎn)蘋果酸菌株情況見表1。Jantama等發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌KJ070能夠利用10%的葡萄糖在24 h內(nèi)生產(chǎn)626 mmol的蘋果酸；Crtereal等研究表明，漢遜酵母具有較好的生產(chǎn)蘋果酸及其他多種四碳二元羧酸的潛力。
1.3 基本代謝路徑研究
類似丁二酸及L-乳酸，蘋果酸的合成路徑引起人們重視，尤其是其工業(yè)化生產(chǎn)調(diào)控。作為四碳二羧酸重要的生產(chǎn)菌，大腸桿菌的代謝途徑被廣泛研究，也可通過琥珀酸產(chǎn)生菌的代謝修飾生產(chǎn)蘋果酸；酵母由于具有很好的pH值耐受性而被人們用于蘋果酸生產(chǎn)，13C同位素示蹤分析表明，Saccharomyces cerevisiae的蘋果酸累積通過丙酮酸的羧化、三羧酸循環(huán)及其逆循環(huán)合成而得；絲狀真菌米曲霉的13C同位素示蹤分析表明，線粒體內(nèi)TCA循環(huán)(三羧酸循環(huán))的活性對蘋果酸的分泌貢獻較大。蘋果酸生物煉制的中心代謝途徑如圖1。分析表明，細菌中蘋果酸的通量主要來源于草酰乙酸的直接代謝；酵母菌中除了草酰乙酸的代謝外，部分蘋果酸來自TCA循環(huán)；絲狀真菌中除了草酰乙酸代謝和TCA循環(huán)代謝外，蘋果酸的通量也來自蘋果酸酶的直接催化以及乙醛酸循環(huán)的代謝。
1.4 關(guān)鍵酶研究
富馬酸酶是生產(chǎn)蘋果酸的重要酶，特別是由富馬酸為原料生產(chǎn)蘋果酸時。已在釀酒酵母中檢測到富馬酸酶，并且在面包酵母細胞中測量到其高比活性。蘋果酸酶在大腸桿菌中介導(dǎo)C3代謝物羧化成C4代謝中起重要作用。研究表明，也可以通過用修飾電級再生輔酶來生產(chǎn)蘋果酸。此外，在米曲霉中檢測到丙酮酸羧化酶和蘋果酸脫氫酶的活性也是影響蘋果酸通量高低的主要原因。
蘋果酸代謝的關(guān)鍵酶見表2。對這些關(guān)鍵酶的分析表明，產(chǎn)生蘋果酸的菌株具有固定CO2的能力，并且參與TCA和乙醛酸鹽循環(huán)的合成。
1.5 代謝改造策略研究
通過對蘋果酸代謝的全-面研究，尤其是全細胞優(yōu)化的研究，人們借助代謝途徑改造生產(chǎn)多種有機酸，包括C4蘋果酸。Ye等通過從Thermococcus kodakarensis中提取蘋果酸酶來構(gòu)建體外人工蘋果酸合成途徑，發(fā)現(xiàn)其對葡萄糖的得率可以達到60%。
為了提高蘋果酸的產(chǎn)量，在大腸桿菌中實施了富馬酸還原酶的敲除以提升產(chǎn)物，根據(jù)蘋果酸的通量來源，削弱富馬酸酶可以增加蘋果酸的產(chǎn)量；同時富馬酸酶的過度表達也可以反過來從下游改善其代謝。對于釀酒酵母K-901H，Vid24p基因功能喪失導(dǎo)致了蘋果酸脫氫酶累積，進而實現(xiàn)蘋果酸產(chǎn)率的提升。所有這些改造策略顯著促進產(chǎn)物代謝。蘋果酸代謝改造策略及效果如表3。
1.6 發(fā)酵工藝研究
對于發(fā)酵過程，通常采用3種類型的發(fā)酵模型，包括深層發(fā)酵、固體發(fā)酵和酶催化。Zou等探討了深層發(fā)酵過程并進行了總結(jié)。Penicillium sclerotiorum K302可以在有氧條件下高產(chǎn)蘋果酸鈣(92.0 g/L)，該深層培養(yǎng)工藝具有較大潛力。寄生曲霉CICC40365深層培養(yǎng)8 d可得到55.47 g/L的蘋果酸，黃曲霉A-TCC13697和米曲霉QM No.821則可通過固體發(fā)酵方法生產(chǎn)蘋果酸。酶生物催化和膜分離過程被應(yīng)用于富馬酸和蘋果酸生物轉(zhuǎn)化。微生物電滲析與細胞催化相結(jié)合的方法也是一個亮點，該方法具有電耗低和外源電子利用的多種底物的優(yōu)點。
1.7 影響發(fā)酵的關(guān)鍵因子研究
影響發(fā)酵的主要因素包括溶解氧、中和劑、微生物形態(tài)、二氧化碳及細胞狀態(tài)等。
微生物在有氧(偶爾厭氧)條件下產(chǎn)生蘋果酸，其中溶解氧在細胞生長中起關(guān)鍵作用。中和劑如Ca(OH)2、Na2CO3和CaCO3通常用于控制有機酸發(fā)酵過程中的pH值。添加50 g/L的CaCO3確保了釀酒酵母在整個蘋果酸發(fā)酵過程中保持很好的發(fā)酵指數(shù)，其中CaCO3通過保持恒定的pH值在蘋果酸生物合成中起重要作用。顯著影響氧轉(zhuǎn)移速率的另一種情況是真菌的形態(tài)，當絲狀真菌在深層培養(yǎng)基中生長時，在不同的發(fā)酵過程中形成不同類型的形態(tài)。代謝網(wǎng)絡(luò)顯示蘋果酸積累的幾種途徑與CO2固定密切相關(guān)，因此CO2影響著蘋果酸的發(fā)酵。對于蘋果酸生產(chǎn)菌大腸桿菌而言，CO2參與磷酸烯醇式丙酮酸及丙酮酸的羧化。在氮饑餓條件下對米曲霉中蘋果酸生產(chǎn)狀況研究表明，氮源亞適量反而會增加蘋果酸的代謝，這可能與TCA循環(huán)的代謝、細胞呼吸和溶解氧吸收間接相關(guān)。
2.1.1 同步糖化發(fā)酵研究
纖維素原料轉(zhuǎn)化為高附加值化學(xué)品(如蘋果酸)主要包括4個加工步驟：原料預(yù)處理、水解、發(fā)酵和產(chǎn)品回收。由于同步糖化發(fā)酵提高了產(chǎn)品的整體轉(zhuǎn)化效率，是未來蘋果酸生物煉制研究的重要發(fā)展趨勢。
2.1.2 提高細胞耐受性的改善策略研究
當碳源從葡萄糖擴展到生物質(zhì)糖時，必須考慮一系列抑-制劑和所產(chǎn)生的細胞耐受性或適應(yīng)性。纖維素糖降解過程中形成或釋放多種細胞抑-制劑，特別是在預(yù)處理過程中。這些抑-制劑對微生物有一定的毒性和負面影響，例如形成的糠醛會導(dǎo)致細胞損傷。研究發(fā)現(xiàn)，參與硫同化途徑的4種基因轉(zhuǎn)錄水平能顯著保護細胞免受糠醛氧化應(yīng)激的影響，也可通過與質(zhì)膜密切相關(guān)的化學(xué)和遺傳擾動來改善細胞對乙酸抑-制劑的耐受性。如果高濃度抑-制劑在發(fā)酵系統(tǒng)中積累，則需要脫毒。
2.1.3 五六碳糖共發(fā)酵研究
拓寬生物質(zhì)糖生物轉(zhuǎn)化蘋果酸的基質(zhì)范圍對其未來成功應(yīng)用至關(guān)重要。EMP途徑的葡萄糖代謝已經(jīng)在大多數(shù)生物體中得到很好的應(yīng)用，六碳糖(低聚糖、纖維二糖、淀粉、蔗糖和麥芽糖)都通過EMP途徑引入或參與葡萄糖代謝。五碳糖(木糖和阿拉-伯糖)是來自生物質(zhì)的水解糖中的重要糖成分，含量僅次于葡萄糖。葡萄糖和木糖共同發(fā)酵蘋果酸對工業(yè)制備蘋果酸具有重要意義。六碳糖和五碳糖的共代謝途徑見圖2。
2.1.4 碳固定化的強化研究
CO2是溫室氣體的主要成分，在蘋果酸發(fā)酵過程中將CO2固定在磷酸烯醇丙酮酸或丙酮酸中會產(chǎn)生較大的益處。CO2的固定效率對蘋果酸的生產(chǎn)有積級作用，碳固定的關(guān)鍵酶主要涉及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、丙酮酸羧化酶和蘋果酸酶。Rhizopus delemar胞內(nèi)的蘋果酸酶活性非常高，在蘋果酸的總產(chǎn)量中，突變菌株中檢測到20%的通量來自蘋果酸酶對CO2的直接固定化。
2.1.5 能量平衡改善代謝研究
對于蘋果酸合成的基本代謝，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和丙酮酸羧化酶合成途徑差異顯著，丙酮酸被PC(丙酮酸羧化酶)催化為OAA(草酰乙酸)的過程凈消耗ATP。當在產(chǎn)生蘋果酸的菌株代謝中檢測到PEPCK和PC時，細胞的ATP能量平衡將起決定性作用；因此，在了解細胞能量供應(yīng)時，分析能量平衡很關(guān)鍵。類似琥珀酸等四碳二羧酸的發(fā)酵，能量不平衡也是菌種高產(chǎn)的瓶頸。當NADH(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸-還原態(tài)，還原型輔酶Ⅰ)細胞供應(yīng)不足時，可以通過氧化還原平衡和調(diào)節(jié)NADH/NAD+(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸-氧化態(tài))比例提升系統(tǒng)能量的穩(wěn)定；同時通過乙酰輔酶A代謝，可以另外獲得NADH，因此可以通過控制電子傳遞鏈來產(chǎn)生ATP。NADPH(還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，還原型輔酶Ⅱ)則在水解糖(包括六碳糖和五碳糖)的蘋果酸生物轉(zhuǎn)化中起重要作用。如果一個菌株中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的代謝成功啟動，這個關(guān)鍵途徑將產(chǎn)生雙倍還原力(NADPH)，以補償能量供應(yīng)，并進而緩解整體代謝還原力[H]的短缺(NADH和NADPH)，這是一種有效改善NADHP平衡的方法。
2.2 蘋果酸生物精煉研究的總體趨勢
2004年，美國能源部將蘋果酸列為未來高附加值生物基化學(xué)品的首-位，蘋果酸將廣泛應(yīng)用于化工、食品和制藥等各領(lǐng)域。由于人體只能代謝L-型蘋果酸，研究人員已經(jīng)提出逐漸使用L-蘋果酸代替混合型DL-蘋果酸，特別是在食品和醫(yī)藥應(yīng)用中，歐美已經(jīng)禁止混合型產(chǎn)品的亂用。由于大多數(shù)蘋果酸產(chǎn)品是通過化學(xué)方法合成的，而富馬酸酶的催化不是真正的一步發(fā)酵，并且反應(yīng)中存在其他化學(xué)殘留的可能，因此，蘋果酸的一步法生物精煉技術(shù)具有重要發(fā)展前景。
未來蘋果酸生物煉制研究總體趨勢為，在原料利用上實現(xiàn)同步糖化發(fā)酵，利用細胞耐受性的改善提高其發(fā)酵適應(yīng)性，并進而提升碳糖的共發(fā)酵、碳固定化及能量平衡能力，以提升蘋果酸產(chǎn)量。
3 結(jié)束語
利用生物煉制手段轉(zhuǎn)化可再生糖制備蘋果酸具有重要意義，其未來的發(fā)展定位是將原來的淀粉質(zhì)糖水解系統(tǒng)逐漸過渡到纖維質(zhì)水解糖系統(tǒng)，而如何克服其生物轉(zhuǎn)化過程中的諸多限制因素至關(guān)重要。本文介紹和總結(jié)了蘋果酸生物煉制流程，包括原料選擇、菌種篩選、基本代謝路徑研究、關(guān)鍵酶研究、發(fā)酵工藝研究以及關(guān)鍵影響因子研究；同時，統(tǒng)籌分析了轉(zhuǎn)化生物體的內(nèi)部代謝與外在條件之間的關(guān)聯(lián)，進而提出蘋果酸生物轉(zhuǎn)化研究的發(fā)展趨勢，期望為蘋果酸生物精煉提供一定參考。
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